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New. Renew. Energy - Vol. 16 , No. 1

[ Article ]
New & Renewable Energy - Vol. 16, No. 1, pp. 59-67
Abbreviation: New. Renew. Energy
ISSN: 1738-3935 (Print) 2713-9999 (Online)
Article No. [2020-3-BE-007]
Print publication date 25 Mar 2020
Received 13 Nov 2019 Revised 23 Dec 2019 Accepted 02 Jan 2020
DOI: https://doi.org/10.7849/ksnre.2020.2056

이산화탄소로부터 생물전기화학적 아세트산 생산을 위한 미생물 농화배양 및 군집 분석
김준형1) ; 김영은1) ; 박명화2) ; 송영은3) ; 설은희4) ; 김중래5) ; 오유관5), *

Microbial Enrichment and Community Analysis for Bioelectrochemical Acetate Production from Carbon Dioxide
Junhyung Kim1) ; Young-Eun Kim1) ; Myeonghwa Park2) ; Young Eun Song3) ; Eunhee Seol4) ; Jung Rae Kim5) ; You-Kwan Oh5), *
1)M.S. Candidate, School of Chemical & Biomolecular Engineering, Pusan National University
2)M.S. Candidate, Department of Civil & Environmental Engineering, Pusan National University
3)Ph.D. Candidate, School of Chemical & Biomolecular Engineering, Pusan National University
4)Researcher, School of Chemical & Biomolecular Engineering, Pusan National University
5)Professor, School of Chemical & Biomolecular Engineering, Pusan National University
Correspondence to : *youkwan@pusan.ac.kr Tel: +82-51-510-2395 Fax: +82-51-512-8563


Copyright © 2020 by the New & Renewable Energy
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Abstract

Microbial electrosynthesis has recently been considered a potentially sustainable biotechnology for converting carbon dioxide (CO2) into valuable biochemicals. In this study, bioelectrochemical acetate production from CO2 was studied in an H-type two-chambered reactor system with an anaerobic microbial consortium. Metal-rich mud flat was used as the inoculum and incubated electrochemically for 90 days under a cathode potential of -1.1 V (vs. Ag/AgCl). Four consecutive batch cultivations resulted in a high acetate concentration and productivity of 93 mmol/L and 7.35 mmol/L/day, respectively. The maximal coulombic efficiency (rate of recovered acetate from supplied electrons) was estimated to be 64%. Cyclic voltammetry showed a characteristic reduction peak at -0.2~-0.4 V, implying reductive acetate generation on the cathode electrode. Furthermore, several electroactive acetate-producing microorganisms were identified based on denaturing- gradient-gel-electrophoresis (DGGE) and 16S rRNA sequence analyses. These results suggest that the mud flat can be used effectively as a microbial source for bioelectrochemical CO2 conversion.


Keywords: Bioelectrochemical system, Carbon dioxide, Acetic acid, Mixed culture, Coulombic efficiency, Microbial community
키워드: 생물전기화학 시스템, 이산화탄소, 아세트산, 혼합배양, 쿨롱효율, 미생물 군집

1. 서 론

전 세계적으로 기후위기(Climate crisis)를 방지하기 위해 온실가스 이산화탄소(CO2)의 저감 및 전환을 위한 다양한 생물학 및 물리화학적 기술이 활발히 연구가 진행되고 있다[1,2]. CO2는 열역학적으로 매우 안정하며 산화된 상태이므로, 환원된 상태의 유용 화학물질 혹은 수송용 연료로 전환하기 위해서는 상당한 양의 에너지 투입이 필요하다. 일반적으로 광합성 생물(식물, 미세조류, 광합성 세균)이 태양 에너지를 이용하여 CO2를 고정화하지만[3] 낮은 태양광 전환효율, 광/암반응 주기 반복에 따른 비연속적인 CO2 전환, scale-up 어려움 등 실제 상용화에는 여러 문제점이 있다[4].

미생물 전기합성 (Microbial electrosynthesis, MES) 기술은 광합성과 달리 빛 에너지를 이용하지 않고 전극으로부터 전자를 환원력(Reducing power)으로 이용하여 CO2를 생물학적으로 고정화할 수 있어 최근 큰 관심을 받고 있다[5]. 산화전극(Anode)의 물 분해 반응으로 생성된 전자는 전압을 인가하는 전위가변기를 통해 환원전극(Cathode)으로 전달되면 ‘전기활성(Electroactive)’ 미생물이 전자를 받아 CO2를 부탄올, 에탄올, 아세트산, 1,3-프로판디올(1,3-Propanediol) 등 다양한 화학제품으로 전환시킬 수 있다[6,7]. 따라서 태양광, 풍력 등 친환경 신재생에너지 기술로 생산된 전기를 에너지원으로 활용한 효율적인 CO2 전환 미생물 전기합성 기술이 개발된다면, CO2 감축 효과와 더불어 새로운 바이오산업기술의 확보가 기대된다[8].

미생물 전기합성 효율은 생물촉매와 생물전기화학 시스템(Bioelectrochemical system, BES)의 다양한 운전인자(전극종류, 분리막, 반응기 형태, 인가전압, 전자매개체, pH, 온도 등)에 영향을 받는다. 이중 생물촉매 성능이 미생물 전기합성 기술의 핵심 인자로 평가된다[9]. 생물촉매는 크게 순수배양(Pure culture)과 혼합배양(Mixed culture)로 구분 할 수 있다. 순수배양의 경우 전자전달 메커니즘 이해와 대사공학/합성생물학 기술을 이용한 목적 생산물 생산에 유리하나, 기술적 난이도와 함께 원료가스에 대한 민감성, 외부 미생물 오염문제 등으로 실용화에 상당한 시간이 소요될 것으로 판단된다.

혼합배양은 생산물의 스펙트럼을 다양화할 수 있으며, 산업용 폐가스에 적용가능하고, 외부미생물 오염이 적고, 운전이 용이한 장점이 있다[10]. 그러나 목적 미생물 군집(Target microbial community)을 얻기 위해서는 적절한 접종 미생물원(Inoculum source) 선택과 농화배양(Enrichment culture) 최적화가 요구된다. 지금까지 혐기성 UASB(Upflow anaerobic sludge blanket) 반응기 슬러지[11], 혐기성 소화조 슬러지[12], 하수처리장 활성슬러지[13], 연못 침전물[14] 등을 다양한 접종원으로 이용한 미생물 전기합성 기술이 보고되었다. 그러나 생산물 생산효율이 낮거나, 농화배양 후 미생물 군집에 대한 정보가 부족해 후속 생물공정 최적화에 많은 어려움이 있었다.

본 연구에서는 생물전기화학 시스템에서 금속이온이 상대적으로 높은 갯벌 슬러지를 접종원으로 이용하여 전기활성 혼합미생물의 농화배양과 CO2 전환 생산물의 가능성을 조사하였다. 그리고 농화배양에 따른 미생물 군집 변화를 분자생물학적 DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis) 기법으로 분석하였고, 확인된 주요 미생물의 생리학적 특성 및 전기활성 가능성을 조사하였다.


2. 재료 및 방법
2.1 식종 슬러지 및 배지 조성

본 실험에 사용된 식종 슬러지는 경남 창원시 봉암갯벌에서 채취하였다. 봉암갯벌은 산업단지 및 공장과 지리적으로 가까워 다양한 공업용 폐수에 노출되어 있으며, 다른 갯벌에 비해 철(Fe)과 같은 금속 농도가 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다[15]. 채취된 슬러지는 사용 전까지 밀폐용기에 담아 4℃ 냉장고에 보관하였다. 생물전기화학 배양을 위해 Im 등이 제안한 무기염 영양배지를 사용하였다[12]. 주요 배지성분은 KH2PO4(1.5 g/L), K2HPO4(2.9 g/L), NaHCO3(2.0 g/L), NH4Cl(0.5 g/L), MgCl2・6H2O (0.09 g/L), CaCl2・2H2O(0.0225 g/L)이며, Wolfe’s mineral solution과 Wolfe’s vitamin solution을 각각 20 mL/L씩 첨가하였다. 최종 배양배지는 HCl 용액으로 pH를 7로 맞춘 후 0.45 µm 멤브레인으로 여과하여 사용하였다. N2:CO2:H2 (72:20:8, v/v/v)의 혼합가스 상태의 혐기성 챔버(Vinyl anaerobic chamber type-B, Coylab, USA)에서 영양배지 10 mL에 5 g의 슬러지 시료를 충분히 혼합하였다. 15분간 정치 후 상등액 10 mL을 1회용 멸균주사기로 생물전기화학반응기에 0.02 OD(Optical density) 수준으로 접종하였다.

2.2 생물전기화학 반응기 및 배양조건

본 연구에서는 두개의 250 mL Pyrex 재질 유리 반응기로 구성된 H-형태 이실형 생물전기화학 반응시스템(H-type two-chambered bioelectrochemical system)을 사용하였다(Fig. 1). 두 반응기는 부착된 연결관을 통해 양이온교환막(Cation exchange membrane, CEM; 50 mm × 50 mm; FKS-PE T-130, FuMA-Tech, Germany)과 고정집게로 연결하였다. 환원전극은 graphite felt(높이 50 mm, 넓이 50 mm, 두께 5 mm; GF-20-5F, Nippon Carbon, Japan)를, 산화전극으로 carbon rod(길이 50 mm, 직경 5 mm; JC4, Ceramaterials, USA)와 50 g carbon granule(직경 2-5 mm)을 동시에 사용하였다. 전압인가를 위해 산화 및 환원 전극에 티타늄와이어(90 mm, 직경 1.6 mm; Ti R/B Gr2, Seoul Titanium CO., Korea)를 전도성 접착제 (Silver paste, CANS, Japan)로 부착하였다. 기준전극으로 3 M의 NaCl이 포화된 Ag/AgCl 전극(RE-5B, BASI, USA)을 환원전극 반응기에 설치하였다.


Fig. 1. 
Photograph of H-type two-chambered bioelectrochemical system

산화전극 및 환원전극 반응기(각 250 mL)의 작용부피(Working vol.)는 200 mL로 동일하였고, 앞서 언급한 영양배지를 공급하였다. CO2로부터 메탄을 생성하는 메탄생성균(Methanogenic bacteria)의 생성을 억제하기 위해 5 mM의 2-bromoethanesulfonate를 환원전극 반응기에 첨가하였다[16]. 환원전극 반응기에는 무기탄소원 CO2 공급을 위해 CO2:N2(40:60, v/v) 조성의 혼합가스를 40 mL/min으로 연속적으로 공급하였다. 미생물의 전기환원 활성을 저해할 수 있는 미량 산소를 제거하기 위해 혼합가스는 300℃ heating mantle(MS-EB, Misung Scientific co, Korea)에 설치한 구리입자(Copper granule, Junsei, Japan) 함유 유리관으로 통과시켰다. 산화전극 반응기에는 환원전극 반응기와 동일하게 40 mL/min으로 N2 가스(99.9%)를 연속적으로 공급하였다.

전압은 전위가변기(Potentiostat; WMPG-1000, Wonatech, Korea)를 사용하여 -0.7~-1.1 V(vs. Ag/AgCl 전극) 범위로 조절하였다. 환원전극 반응기는 원활한 영양분 혼합을 위해 자석교반기(IKA color squid, IKA, Germany)와 마그네틱 바로 200 rpm에서 교반하였다. 산화전극 반응기는 별도로 교반을 하지 않았다. 모든 생물전기화학 반응실험은 항온실(28~30℃)에서 진행하였다.

2.3 분석방법

균체성장 및 CO2 전환 대사산물 분석을 위해 1~3일 간격으로 환원전극 반응기의 샘플링 포트를 통해 시료를 1 mL 일회용 멸균주사기로 채취하였다. 균체농도는 UV-Vis 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer; Optizen 3220UV, Mecasys, Korea)를 사용하여 600 nm 파장에서 흡광도(Absorbance)로 측정하였다[17]. 대사산물(유기산과 알코올)은 배양액을 0.2 ㎛ 주사기필터(CA-CN, QingFeng Filter Equipment Co, China)로 여과한 후 DAD(Diode array detector)와 RID(Refractive index detector)가 설치된 고성능 액체크로마토그래프(High-performance liquid chromatograph, HPLC; Agilent 1100, Agilent Inc, USA)로 분석하였다. 분석칼럼은 Aminex HPX-87H ion exclusion column(300 mm × 7.8 mm)이었고, 이동상은 2.5 mM 황산용액을 사용하였다. 칼럼온도 및 주입부피는 각각 65℃ 및 10 ㎕이었다.

2.4 순환전압전류 분석 및 쿨롱효율 계산

생물전기화학 반응기내 전극을 통한 산화, 환원 반응의 유무와 특성을 알아보기 위해 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV) 분석을 실시하였다. 전위가변기로 반응기의 인가전압을 -1.2 V~+0.2V 범위 내에서 10 mV/s 속도로 변화시켜 전류변화를 분석하였다. 산화반응은 인가전압이 증가하는 반응 사이클에서 양의 방향으로 곡선이 관찰되고, 환원반응은 인가전압이 다시 감소할 때 음의 방향으로 곡선이 나타난다[18].

쿨롱효율(Coulombic efficiency, CE)은 아래 식과 같이 반응시간 동안 투입된 총 전하량(쿨롱) 대비 생산물 생성으로 회수된 전하량에 대한 비율로 계산하며, 전기활성 생물촉매의 효율지표로 사용된다[18].

CE%=n×F×m0tIdt×100%(1) 

총 전하량은 전위가변기를 통해 기록된 전류의 양(I)을 전체 반응시간으로 적분하여 계산한다. n은 1 mole 대산산물의 생성을 위해 필요한 전자 수, F는 패러데이 상수(96,485 C/mole of e-), m은 대사산물의 몰 생산량(mole)을 의미한다.

2.5 DGGE를 이용한 미생물 군집 분석

미생물 군집은 변성구배 젤 전기영동법(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)으로 배양 초기(0일), 중간(60일), 종료(90일) 시점 등 세 차례 분석하였다. 혼합미생물 DNA는 DNA 추출키트(FastDNA SPIN Kit for Soil & Feces, MP Biomedicals, USA)로 추출하였다. 추출된 DNA로부터 16S rRNA를 증폭하기 위해 1차로 universal primer인 27F primer와 1492R primer를, 2차로 GC clamp가 부착된 341F-GC primer와 518R primer를 사용하였다[19]. 유전자 증폭은 PCR premix system(BioFACT, Korea)을 이용하여 수행하였다.

DGGE 분석을 위해 45~55%(변성제 농도 100%는 7 M urea와 40% formamide를 의미)의 농도구배가 있는 아크릴아마이드젤(Acrylamide gel)을 제조하여 사용하였다. PCR 산물을 젤에 주입한 후 DcodeTM Universal Mutation Detection system(Bio-Rad Laboratories, USA)에서 60℃에서 20 V에서 10분간, 60 V에서 16시간 동안 전기영동을 수행하였다. DGGE band는 SYBR Gold staining (Invitrogen, USA) 시약으로 염색하였고, Molecular Imager Gel DocTM XR+ System(Bio-Rad Laboratories, USA)으로 확인하였다. 시퀀스 분석을 위하여 HiGeneTM Gel & PCR Purification System(BioFACT, Korea)을 사용하여 16S rRNA를 분리하였고, 분리된 유전자는 341F primer와 518R primer을 이용하여 재 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제 후 All in OneTM PCR Cloning Kit(BioFACT, Korea)를 이용하여 클로닝을 통해 시퀀스 분석을 하였다. 최종적으로 EzBioCloud(www.ezbiocloud.net) database에서 시퀀스 분석을 통해 미생물을 동정하였다[20].


3. 결과 및 고찰
3.1 미생물 농화배양을 통한 전기활성 균체성장 및 아세트산 생산

Fig. 2는 독립영양조건에서 생물전기화학적 CO2 전환을 위한 전기활성 혼합미생물 농화배양 및 아세트산 생산 결과를 나타낸다. 철과 같은 금속 농도가 상대적으로 높은 봉암갯벌에서 채취한 슬러지의 현탁액을 0.02 OD 수준으로 생물전기화학 반응기에 접종하였고, 90일간 3번의 계대배양을 실시하였다(Fig. 2, Stage I~IV). 반응기 운전동안 전압은 -1.1 V(vs. Ag/AgCl)로 고정하였고, 무기탄소원으로 CO2를 포함한 혼합가스(CO2:N2=40:60)를 연속 공급하였다.


Fig. 2. 
Microbial enrichment and acetate production from CO2 for 90 days using bioelectrochemical system. OD600 (●) and acetate (○). Roman numbers represent repeated batch cultures at 1.1 V

접종초기 6일 동안 OD 증가가 없었으나, 이후 상당한 미생물 성장이 관찰되었다(Stage I). 배양액을 HPLC로 분석하였을 때 흥미롭게도 아세트산만이 생물전기활성 대사산물로 관찰되었다. 또한 아세트산은 균체농도 증가와 거의 비례적으로 증가하였다. 운전 14일 후 혼합미생물 및 아세트산 농도는 각각 0.26 OD 및 54 mmol/L이었다. 이러한 결과는 접종된 슬러지 미생물들이 전기활성 배양조건에서 성장하고 아세트산을 생산하는데 어느 정도 적응시간이 필요하다는 것을 나타낸다.

두 번째 배양은 전기활성 배양효율을 높이기 위해 두 가지 계대배양 방법의 효율을 조사하였다. 첫 번째로 앞서 14일간 운전한 생물전기화학 반응기의 환원전극을 혐기성 챔버에서 새로운 생물전기화학 배양기에 옮기고, 새로운 영양배지를 첨가하여 운전하였다. 그러나 12일 간의 장기간 배양에도 불구하고, 앞선 운전(Stage I, 54 mmol/L)보다 상당히 낮은 21 mmol/L의 아세트산 생산이 관찰되었다. 이 결과는 본 실험조건의 전기활성 미생물들이 생물막(Biofilm) 형태로 전극과의 직접적인 전자전달보다는 수소와 같은 전자전달 매개체에 대한 의존도가 높아 대부분 부유상태로 존재함을 나타낸다. 실제로 환원전극에서 생물막은 육안으로 관찰하기 어려웠다. 두 번째 방법으로 전기활성 배양액을 새로운 생물전기화학 반응기에 8%(v/v) 수준으로 접종하였다(Fig. 2, Stage II). 첫 번째 배양(Stage I)과 달리 접종 후 지체기 없이 균체성장이 관찰되었다. 균체성장은 총 46일간 꾸준히 증가하여 최종 OD는 0.41에 이르렀다. 아세트산 생산은 접종 후 약 10일간 느리게 증가하였지만, 이후 급속한 증가가 관찰되었다. 배양 46일 후 최대 아세트산 생산농도는 98 mmol/L이었다. 이후 농화배양은 앞선 배양액 일부를 새로운 반응기에 접종하는 식(8%, v/v)으로 진행하였다.

세 번째와 네 번째 배양은 균체성장과 아세트산 생산이 미생물 접종 직후부터 바로 증가하였다(Fig. 2, Stage III과 IV). 세 번째와 네 번째 배양의 경우 배양기간이 일부 차이가 났지만 최종 균체농도와 아세트산 농도는 각각 약 0.3 OD 및 90 mmol/L로 유사하였다. 아세트산 생산속도는 6.37∼7.35 mmol/L/d 범위로 stage I, II(2.04∼3.64 mmol/L/d)에 비해 2배 이상 증가하였다. 이는 본 생물전기화학 조건에서 CO2 전환 전기활성 미생물들의 농화 배양이 적절히 진행되었음을 나타낸다.

3.2 전기 이용 아세트산 전환 효율

Fig. 3은 전기활성 혼합미생물의 네 차례 농화배양동안 투입전기(전자)의 아세트산 전환 쿨롱효율을 나타낸다. 첫 번째 배양의 쿨롱효율은 52%이였고, 두 번째는 다소 낮았지만 이후 계대배양에 따라 쿨롱효율이 증가하는 경향이 관찰되었다. 최대 쿨롱효율은 4차 배양 후 68%로 가장 높았고, 첫 번째 배양 대비 29% 증가하였다. 이는 앞선 아세트산 생산속도의 증가와 함께 CO2를 아세트산으로 전환하는 미생물 군집이 전체 배양액 내 우점종이 되고 있음을 나타낸다.


Fig. 3. 
Coulombic efficiencies of different culture stages during bioelectrochemical operation (See also Fig. 1 for stages I to IV)

Table 1은 본 연구에서 관찰된 쿨롱효율과 아세트산 농도 및 생산성을 다양한 미생물 접종원을 사용한 문헌과 비교한 결과를 나타낸다. CO2 전환 생물전기화학 성능은 미생물촉매의 전기활성 뿐만 아니라 다양한 반응기의 운전조건(이온교환막, 전극 종류, 인가전압, 외부 전자매개체 공급 여부 등)에 따라 달라질 수 있으므로 단순비교는 어렵다. 그럼에도 불구하고 본 연구의 최대 아세트산 농도(93 mmol/L) 및 생산성(7.35 mmol/L/d)과 쿨롱효율(64%)은 여러 문헌[9,11,12,19]에 비해 전반적으로 우수한 것으로 판단된다. 이는 갯벌슬러지가 생물전기화학 CO2 전환을 위한 미생물 공급원으로 효과적으로 사용 가능하다는 것을 나타낸다. 아세트산 생산성 및 쿨롱효율의 최적화를 위해서는 혼합미생물의 생리학, 생화학, 분자생물학적 특성을 고려한 추가적인 공정최적화 연구가 필요하다고 판단된다.

Table 1. 
Comparison of acetate production from CO2 using mixed culture in bioelectrochemical system
Inoculum source Membrane* Cathode Ecathode
(V vs SHE)
Max.
acetate titer
(mmol/L)
Max. acetate
production rate
(mmol/L/d)
Coulombic
efficiency
(%)
Ref.
UASB sludge CEM Carbon felt -1.26 21.9 1.00 58.0 [11]
Activated sludge from
sewage treatment plant
CEM Carbon felt -0.95 1.59 1.59 28.4 [13]
Microbial consortium
from pond sediment
CEM NanoWeb-RVC -0.85 27.5 0.50 70.0 [14]
Anodic effluent from
MFC
PEM 3D graphene
-nickel foam
-0.85 93.2 3.17 70.0 [19]
Anaerobic digester
sludge from wastewater
treatment
PEM Graphite carbon felt -0.91 86.3 9.51 82.0 [12]
Mud flat CEM Graphite carbon felt -0.90 93.0 7.35 64.0 This study
* CEM: Cation exchange membrane, PEM: Proton exchange membrane, BPM: Bipolar membrane, SHE: Standard hydrogen electrode

3.3 순환전압전류 분석

Fig. 4는 미생물을 접종하지 않은 대조군(Abiotic)과 14일간 배양 후 전기활성 배양액(Biotic)에 대한 순환전압전류법(CV) 분석결과를 보여준다. Abiotic의 경우 인가된 전압 범위(-1.2~+0.2 V vs. Ag/AgCl)에서 뚜렷한 전류변화가 관찰되지 않았다. 반면 biotic 조건에서는 전압변화에 따라 전류변화가 큰 차이로 확연하게 관찰되었다. 인가전압이 증가하면서 전류변화의 양의 방향으로 나타나는 곡선은 산화반응을 의미하며 전압이 감소하면서 음의 방향으로 나타나는 곡선은 환원반응을 나타낸다[18]. 산화반응에 해당하는 곡선은 분명하지 않지만, 환원반응은 약 -0.4~-0.3 V 부근에서 크고 뚜렷한 환원전위 피크가 관찰되었다. 아세트산의 표준 환원전위는 -0.3 V로 알려져 있다[7]. 순환전압전류법 분석은 각 계대배양이 종료된 시점에 반복하여 수행하였으며, 동일하게 -0.2~-0.4 V에 부근에서 유사한 환원전위 피크가 관찰되었다. 이는 본 연구에서 농화배양된 혼합미생물이 환원전극 반응기 내에서 전극으로 부터 전자를 받아 CO2를 아세트산으로 환원하는 생물전기활성 반응을 일으키는 것을 나타낸다.


Fig. 4. 
Cyclic voltammograms (CVs) of biotic and abiotic cultures. CVs were measured at 14 days. The scan rate was 10 mV/s

3.4 미생물 군집 변화

전기활성 혼합미생물의 농화배양에 따른 미생물 군집변화를 DGGE로 분석하였다. DGGE는 변성제로 농도구배를 형성한 젤 내에서 여러 유전자들을 분리하는 분석법이다[2]. 각 미생물의 염기서열은 고유한 융해특성을 가지므로 겔 상에서는 서로 다른 밴드로 분리된다. 분석시료는 접종 갯벌 슬러지(0일)와 배양 60일 및 90일차에 채취하였으며, Fig. 5에서 각각 S, M, F 라인으로 표현하였다. S 라인은 M과 F 라인에 비해 DGGE 밴드의 개수가 많고 연하였다. 또한 각 밴드들이 비교적 균일한 세기로 나타났다. 이는 특정 우점종 없이 다양한 미생물들로 구성되며 생체량이 적은 군집임을 나타낸다.


Fig. 5. 
DGGE profiles of 16S rRNA fragments. The fragments were PCR-amplified from the total DNA extracted from the cathodic microbial suspension. Lines: S, BES inoculum; M and F, microbial samples taken from the reactor at 60 and 90 days, respectively. Arrows indicate DNA bands that were extracted and analyzed for nucleotide sequences

두 번째 배양이 종료된 60일차 시료(M 라인)는 분석된 16개의 밴드 중 9개가 S 라인에 비해 진한 세기를 보였다. 진한 밴드는 Dysgonomonas oryzarvi(2번), Thioclava pacifica (3번), Arcobacter spp.(4번, 6번, 7번), Acetobacterium malicum(10번), Sporomusa paucivorans(12번), Rhodobacter vinaykumarii(13번), Oscillospira guilliermondii(15번), Lentimicrobium saccharoilum(17번) 종으로 확인되었다. Sporomusa 종은 전자공여체를 이용하여 CO2를 고정하고 아세트산을 생산하는 독립영양 미생물로 알려졌다[22]. Arcobacter butzleri의 경우 미생물연료전지(Microbial fuel cell, MFC)에서 처음 분리되었으며 exoelectrogenesis 활성이 보고되었다[23]. Arcobacter cryaerophilus 역시 putative exoelectrogen으로 분류되었으며[24], MFC에서 부유 상태로 중요한 역할을 한 것으로 보고되었다[25]. R. vinaykumarii는 M 라인에서 밴드 세기가 가장 선명하게 관찰되었다. R. vinaykumarii는 purple non-sulf ur bacterium으로 아세트산과 같은 유기물(탄소원)을 전자공여체로 사용하여 생장하는 미생물로 알려져 있다[26]. D. oryzarvi의 경우 혼합미생물을 이용한 MES 시스템의 환원전극 반응기[27]와 산화전극 반응기[28] 모두에서 발견되었으므로 외부 전자전달 활성을 보유할 가능성이 높을 것으로 판단된다.

네 번째 배양이 종료된 90일차 시료(F 라인)에서는 60일차 시료(M 라인)와 유사한 DGGE 밴드 패턴을 보였으나, 특정 밴드들의 세기가 증가 또는 감소하였다. 배양시간이 지남에 따라 세기가 강해진 밴드들은 Acetobacterium wieringae(9번), Sporomusa sphaeroides(14번), Oscillospira guilliermondii(15번), Lentimicrobium saccharophilum(17번)이었다. Homoacetogen에 속하는 S. sphaeroides는 Fe(0)로부터 전자를 받아 CO2를 이용하여 아세트산을 생산할 수 있는 종으로 알려져 있다[29]. 또한 Nevin et al.[30]S. sphaeroides가 환원전극으로부터 전자를 받아 아세트산을 생성하는 것을 보고하였다. Oscillospira guilliermondiiLentimicrobium sacchar ophilum도 MFC의 산화전극 반응기에서 발견된 보고가 있다[23,26]. 이외에도 아세트산 생성 미생물인 Acetobacterium spp.(1번, 9번, 10번)가 발견되었다. R. vinaykumarii는 밴드 세기가 M 라인보다 F 라인에서는 다소 감소하였다. CO2 이용 전기활성이 있을 것으로 추정되는 D. oryzarvi(2번)도 확인되었다.

전기화학 조건에서 90일간 농화배양된 미생물 군집을 DGGE로 분석하였을 때 전체적으로 아세트산을 생산하는 acetogen으로 알려진 미생물들이 우위를 차지함을 확인하였다. 그러나 본 생물전기화학 시스템에서 아세트산 외 다른 대사물질들이 관찰되지 않았지만, 군집 내 다양한 미생물간의 공생관계(Syntrophic association)의 가능성도 있을 것으로 판단된다. 즉 CO2로부터 아세트산을 주요 산물로 생산하는 독립영양 미생물들과 함께, 이들 미생물이 생산하는 수소, 유기산, 에탄올 등의 대사산물을 이용하여 생장하는 종속영양 미생물들도 복잡한 영양관계를 가지고 군집을 형성할 수 있다[31]. 따라서 생물전기화학 유용물질 생산기술의 효율 최적화를 위해서는 미생물 공생관계 및 군집형성에 대한 생리학, 생화학 및 분자생물학적 특성에 대한 추가연구가 필요하다.

Table 2. 
BLAST analysis results comparing DGGE band-sequence similarities to those in database
Band no* Best match in BLAST analysis (Accession no.) Similarity (%) Taxonomic description (class)
1 Acetobacterium tundrae DSM 9173 (AJ297449) 99 Clostridia
2 Dysgonomonas oryzarvi (AB547446) 99 Bacteroidia
3 Thioclava pacifica DSM 10166 (AUND01000024) 99 α-proteobacteria
4 Arcobacter cryaerophilus strain L406 305 (LRUV01000021) 99 ε-proteobacteria
5 Uncultured epsilon proteobacterium clone (JX570599) 99 ε-proteobacteria
6 Arcobacter butzleri RM 4018 (CP000361) 100 ε-proteobacteria
7 Arcobacter cryaerophilus CCUG 17081 (L14624) 99 ε-proteobacteria
8 Methylosinus trichosporium OB3b (ADVE01000118) 99 α-proteobacteria
9 Acetobacterium wieringae DSM 1911 (LKEU01000008) 100 Clostridia
10 Acetobacterium malicum DSM 4132 (X96957) 99 Clostridia
11 Sulfurovum denitrificans eps51 (LC322101) 100 ε-proteobacteria
12 Sporomusa paucivorans DSM 3697 (FR7499.9) 99 Negativicutes
13 Rhodobacter vinaykumarii DSM 18714 (jgi.1096505) 99 α-proteobacteria
14 Sporomusa sphaeroides DSM 2875 (AJ279801) 98 Negativicutes
15 Oscillospira guilliermondii OSC5 (AB040499) 100 Clostridia
16 Uncultured actinobacterium clone u72 (GQ850547) 95 Acidimicrobiia
17 Lentimicrobium saccharophilum TBC1 (DF968182) 92 Bacteroidia
18 Uncultured bacterium clone CI5cm.A08 (EF208679) 99 α-proteobacteria
19 Sulfurimonas gotlandica GD1 (ABXD01000011) 98 ε-proteobacteria
20 Uncultured bacterium clone P9X2b8E03 (EU491326) 99 γ-proteobacteria
21 Uncultured gamma proteobacterium (AM882560) 99 γ-proteobacteria
* The bands are numbered according to Fig. 5.


4. 결 론

본 연구에서는 접종원으로 갯벌 슬러지를 이용하여 생물전기화학반응 시스템에서 CO2 전환 전기활성 혼합미생물의 농화배양 및 미생물군집 분석을 수행하였다. 접종 후 90일간 3번의 계대배양을 통해 93 mmol/L 및 7.35 mmol/L/d의 우수한 아세트산 농도와 생산성을 얻었다. 이 때 전자의 아세트산 전환 쿨롱효율은 64%이였다. 순환전압전류 분석을 통해 아세트산 환원전위와 유사한 -0.2~-0.4 V 부근에서 뚜렷한 환원전위 피크가 관찰되었다. 분자생물학적 DGGE 분석결과는 농화배양을 따라 미생물군의 조성 및 농도가 상당히 바뀌었음을 나타낸다. 이들 결과들은 금속이온이 풍부한 갯벌슬러지가 생물전기화학 CO2 전환을 위한 미생물 공급원으로 효과적으로 사용 가능하다는 것을 나타낸다.


Nomenclature
BES : bioelectrochemical system
CE : coulombic efficiency
CV : cyclic voltammetry
HPLC : high-performance liquid chromatograph
MFC : microbial fuel cell
MES : microbial electrosynthesis
OD : optical density

Acknowledgments

본 연구는 한국에너지기술연구원의 주요사업(B9-2442-04)과 과학기술정보통신부 한국연구재단(NRF-2019R1A2C1003463)의 지원을 받아 수행하였습니다.


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